作為漢朝最「牛氣」的開國功臣，周昌是漢高帝劉邦的老鄉，年輕時跟堂兄周苛一起擔任泗水卒史（低級官吏）。當時，劉邦擔任泗水亭長（相當于現在的鄉鎮派出所所長），跟周氏兄弟不僅是同僚，而且還頗有一番交情。跟蕭何、曹參等人一樣，自從劉邦在沛縣起兵反秦后，周氏兄弟便加入他的隊伍中，屬于最初、最忠實的追隨者。

周昌以以直言敢諫、糾彈不避權貴著稱

​周昌最初在軍中擔任職志（掌管旗幟的小官），因為在此后屢立戰功，官職、爵位隨之不斷得以升遷。等到劉邦出任漢王后，周昌已經被提拔為中尉（相當于衛戍區司令）。漢王四年（前203），時任御史大夫的周苛被項羽逮捕、烹殺后，周昌接任這項職務，并因此后的一系列戰功，在漢朝建立后，得以被劉邦冊封為汾陰侯。

在秦漢兩朝，御史大夫相當于副丞相，肩負著監察、彈劾百官的職責。據史書記載，周昌質樸少文、性格剛強，在擔任御史大夫期間，以直言敢諫、糾彈不避權貴著稱，因而多次受到劉邦的嘉獎。正因如此，包括相國蕭何、大功臣曹參等人在內的文武百官全都害怕周昌，每次見到他時都不免低聲下氣，生怕遭到彈劾（「昌為人彊力，敢直言，自蕭、曹等皆卑下之。」《史記·卷九十六》）。

相國蕭何及其他官員都畏懼周昌

​周昌忠于職守，豈止是對百官不留情面，就連身為皇帝的劉邦，也領教過他的火爆脾氣。某次，周昌在皇帝休息時入宮奏事，恰巧看到劉邦正跟戚夫人摟抱親熱，因為覺得很難為情，便低頭屈身，匆匆地退出去。劉邦被周昌壞了興致，心中很不爽，便跑出去追趕周昌，然后騎在他的脖子上罵大街。

不僅如此，劉邦還略帶調侃地問周昌：「你看朕是個什麼樣的皇帝？」

周昌是個愛惜身份的人，因為受不了劉邦羞辱，在憤怒情緒的驅使下便脫口罵道：「陛下跟夏桀、商紂一樣，都是暴君！」劉邦聽后先是一愣，隨即便意識到自己的失禮之處，于是便笑著安慰周昌，就此化解一場尷尬。經此一事，劉邦對周昌敬畏不已（「高帝方擁戚姬，昌還走，高帝逐得，騎周昌項，問曰：‘我何如主也？’昌仰曰：‘陛下即桀紂之主也。’于是上笑之，然尤憚周昌。」引文同上）。

劉邦戲弄周昌，結果招來一通臭罵

​劉邦因為太子劉盈生性仁柔，擔心他將來難以承擔社稷重任，因此便想改立戚夫人所生的皇子劉如意為儲君。某日，劉邦將周昌召進宮中，將改易儲君的想法透露給他，希望他能起帶頭作用，說服群臣擁護這項決定。

沒想到周昌斷然拒絕，聲稱就算是把自己罷免，也堅決不會奉詔。劉邦見周昌執拗如此，雖然一直微笑不語，但心中卻很清楚，易儲之事已沒有任何成功的可能。

讓劉邦、周昌沒想到的是，就在他們進行密談之時，呂后卻隱藏在殿內東廂，將君臣之間的一番對話聽了個清清楚楚。呂后因為感激周昌，所以事后在見到他時，便向他跪謝道：「如果沒有您的據理力爭，太子險些就要被廢黜了。」經此一事，呂后對周昌感激不盡（既罷，呂后側耳于東箱聽，見周昌，為跪謝曰：「微君，太子幾廢。」引文同上）。

因為太子一事，呂后曾跪謝周昌

​太子劉盈固然保住了位子，但作為競爭對手的劉如意，處境卻變得無比兇險起來，搞不好將來還有性命之憂。劉邦正是出于這種擔憂，便決定派一位忠誠可靠，而且深為呂后敬畏的重臣去輔佐劉如意，以幫助他免于殺身之禍。

最終，劉邦選中了周昌，并任命他為趙國相國，以輔佐當時已被冊立為趙王的劉如意，時在高祖十年（前197年）。

周昌雖然并不樂意輔佐劉如意，但礙于君命難違，加之劉邦的殷殷重托，卻也只能勉為其難。周昌的確是個值得托付之人，在劉邦駕崩、惠帝劉盈登基后，多次婉拒呂后對劉如意的召喚令，始終不肯讓后者入朝，以免會遭遇毒手（「使者三反，周昌固為不遣趙王。」引文同上）。呂后對周昌的做法很生氣，但念及他有大恩于自己，卻也是無可奈何。

劉如意最終被呂后害死

​為了能達到謀害劉如意的目標，呂后最終用了一招「調虎離山」之計，先是把周昌召回長安進行監視，然后才將劉如意召入皇宮并毒死，時在漢惠帝元年（前194年）。雖然劉如意遇害跟他沒有關系，但周昌依然覺得自己有負劉邦的托付，所以此后便一直郁郁不樂，整日躲在家中養病，再不肯上朝。就這樣過了2年時間，周昌在家中薨逝，時在漢惠帝三年（前192年）。